随着现代社会压力增加和大脑老化，认知和学习障碍已成为严重的亚健康问题。此外，一些神经退行性疾病被认为是丧失自我照顾、痴呆、丧失记忆和威胁生命安全的危险因素（如亨廷顿病、帕金森病和阿尔茨海默病）。认知和学习障碍对生活质量和福祉的有害影响，迫切需要通过社会策略解决。越来越多的证据表明，生物活性肽在减轻环境和年龄引起的记忆障碍中起重要作用。这些肽具有降低活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平和增强超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性的能力，从而保护PC12细胞。此外，研究发现生物活性肽作为微生物-肠-脑轴衰减神经疾病的新方法。具体来说，肠道微生物群及其代谢物可能通过减少微生物代谢产生的ROS、刺激肠内分泌细胞和影响免疫系统来影响肠神经系统和中枢神经系统。此前有报道称，海参肽（sea cucumber peptides，SCP）具有多种健康益处，包括抗氧化、抗糖尿病、抑制血管紧张素转换酶、免疫调节、抗癌、抗疲劳、抗衰老、神经保护和微矿物质螯合。此外，研究发现SCP在东莨菪碱诱导的认知功能障碍小鼠模型组具有保护记忆活性的作用，能够起到调节胆碱能系统、提高组蛋白（H3和H4）乙酰化水平、降低长期增强通路中赖氨酸乙酰化水平的作用。然而，SCP在海马蛋白水平上对神经保护分子机制的综合调控尚不清楚。记忆是一个复杂的系统，由各种认知过程组成。因此，记忆障碍涉及多种细胞信号通路，主要包括氧化应激、神经炎症、神经递质信号紊乱、神经元死亡和突触可塑性损伤。例如，神经递质信号长时间失调可能引发突触可塑性异常，随后导致神经细胞形态和功能异常。因此，本研究探讨SCP的神经保护机制，并利用蛋白质组学技术，通过对蛋白质进行大规模和深入的分析，为研究所涉及的分子机制提供一种新的方法。海马蛋白质组学策略对于研究人员探索神经保护治疗具有重要意义。此外，利用蛋白质组学技术研究生物活性肽作为抗记忆障碍营养品的分子机制研究较少。大连工业大学食品学院海洋食品加工与安全控制全国重点实验室、辽宁省特殊膳食用食品工程研究中心、国家海洋食品工程技术研究中心、海洋食品精深加工关键技术协同创新中心的Lu Zhiqiang（第一作者）和林松毅（通信作者）等研究旨在探讨SCP对东莨菪碱致小鼠记忆损伤保护作用的分子机制和调控途径。采用行为学实验研究SCP的神经保护作用。随后，采用非标记蛋白质组学技术和生物信息学方法鉴定神经系统的主要功能和通路。此外，筛选和分析了显著富集的通路和功能。最后，采用Nano-高效液相色谱-串联质谱（Nano-high performance liquid chromatography-mass spectrum-mass spectrum，Nano-HPLC-MS-MS）技术鉴定SCP的肽段序列。在水迷宫实验中，记忆损伤程度随时间的增加而增加。在小鼠正常摄食期间（第10～30天），对照组、吡拉西坦组和模型组小鼠在逃避潜伏期无显著差异。而L-SCP组、M-SCP组和H-SCP组小鼠的逃避潜伏期呈下降趋势，其中H-SCP组小鼠的曲线更为陡峭。研究表明，摄入SCP可能以剂量依赖的方式增强正常小鼠的学习和记忆能力。东莨菪碱给药7 d（第37天）后，模型组小鼠的逃避潜伏期较对照组显著高于对照组，提示模型组小鼠记忆能力下降，建立记忆障碍模型。此外，与模型组相比，L-SCP组、M-SCP组和H-SCP组小鼠的逃避潜伏期均显著降低，其中H-SCP组的逃避潜伏期最短。被动测试的行为表现与水迷宫测试相似（图1D）。注射东莨菪碱前10 d各组小鼠进入暗室次数差异无统计学意义；但SCP组进入暗室的次数在接下来的20 d逐渐减少，其他3 组保持不变。小鼠给予东莨菪碱治疗1周（第37天）。SCP组和模型组的电击次数均高于未加东莨菪碱组。此外，M-SCP组、H-SCP组、对照组和吡拉西坦组有相似的结果，且明显低于模型组。SCP在正常小鼠中表现出增强作用，因为它含有这种神经保护肽。吡拉西坦被认为是γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）的衍生物，通过调节胆碱能系统和其他神经递质（如单胺和谷氨酸能神经递质）发挥神经保护作用。在本研究中，与模型组相比，L-SCP组、M-SCP组和H-SCP组小鼠在水中的逃生时间更短，在被动回避测试中进入暗室的次数更多，其中H-SCP组效果最好。因此，水迷宫和被动回避实验的行为表现均表明，SCP摄入可预防东莨菪碱引起的学习记忆障碍，且具有剂量依赖性。A. 实验示意图；B. 实验组和药物剂量；C. 水迷宫实验小鼠的行为表现；D. 被动回避实验小鼠的行为表现。所有实验重复10 次。不同的字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
通过MS-MS谱数据库获得鉴定信息如下：多肽（59 398）、特异肽段（54 833）、鉴定蛋白（5 803）、可定量蛋白（5 014）（图2B）。从MS-MS谱中鉴定的上述大多数蛋白质具有高序列覆盖率（图2C）。肽长度分布如图2D所示。大部分肽由7～20 个氨基酸组成，符合胰蛋白酶水解断裂的一般规律。肽质谱的误差在1×10－5以内（图2E）。结果表明，质谱分析的准确度满足实验要求。主成分分析（principal component analysis，PCA）对胰岛进行分类，结果表明SCP组和模型具有可靠的重复性（图2G）。共鉴定出94 种DEPs蛋白。在SCP模型中，发现80 个蛋白上调，14 个蛋白下调（图2F）。同时，绘制火山地图，显示DEPs和其他鉴定蛋白的分布（图2H）。一些记忆相关蛋白水平在DEPs中显著升高（P＜0.05）。
A. 分析小鼠海马蛋白质组的实验流程；B. MS-MS鉴定信息；C. 肽段覆盖率；D. 肽段长度分布；E. 肽段质量容差；F. 模型组与SCP组间DEPs数量；G. PCA分析；H. DEPs的火山图。图2 海马蛋白质组学的实验方法和其他信息
与对照组相比，模型组海马乙酰胆碱（acetyl cholin，Ach）含量明显降低。但吡拉西坦组和SCP组小鼠海马中Ach含量较模型组显著升高。在所有组中，模型组乙酰胆碱酯酶（acetylcholin esterase，AChE）活性最高。H-SCP组AChE活性低于其他SCP组，与对照组无显著差异。蛋白质组学数据显示，SCP小鼠海马胆碱乙酰转移酶（choline acetyltransferase，ChAT）水平是模型组的1.6 倍。研究发现，SCP可能通过调节ACh含量和AChE活性来保护海马胆碱能系统。SCP组ChAT水平的上调可能有助于记忆功能的改善，提示SCP可能通过调节海马胆碱能系统来保护记忆功能。结合GO功能分类分析，HE染色检测小鼠海马CA1、CA3区神经元形态。模型组海马CA1区和CA3区神经元排列松散，膜、核不清。此外，一些神经细胞呈空泡样结构，没有细胞核。此外，研究对海马CA1和CA3区域的神经细胞损伤进行量化（图3H）。SCP给药导致神经损伤的剂量依赖性减少。然而，口服L-SCP对CA3区没有显著影响，仅对CA1区有很小的影响。因此，研究结果表明，东莨菪碱对海马神经元有损害作用，并可能损害认知功能。然而，SCP能以剂量依赖性的方式阻止正常排列和形态的细胞被破坏。总体而言，SCP可以保护海马神经元形态以对抗记忆障碍。
A. 细胞成分；B. 分子功能；C. 生物过程；D. Ach含量；E. AChE活性；F. CA1区HE染色；G. CA3区HE染色；H. CA1、CA3区神经元细胞损伤程度。
图3 H-SCP模型上调DEPs及胆碱能系统和神经细胞的GO分析
在本研究中，观察到东莨菪碱管理导致PSD-95和抗突触素（anti-synaptophysin，Syn）水平的降低。相反，SCP处理导致这些蛋白的表达增加，其作用依赖于给药剂量（图4）。结果表明，SCP对东莨菪碱引起的突触可塑性损伤具有保护作用，且大剂量SCP的保护效果最好。与健康小鼠相比，患有记忆障碍的小鼠通常表现出突触密度和大脑突触结构的异常减少。值得注意的是，许多分子，如离子通道、信号分子和细胞骨架蛋白，在突触可塑性中起着至关重要的作用。研究表明，SCP增强了突触的可塑性。因此，SCP能有效防止东莨菪碱引起的突触可塑性破坏。Western blotting分析蛋白相对表达量，内参蛋白β-actin。免疫印迹图，A. PSD-95，B. Syn；相对表达水平，C. PSD-95，D. Syn。
海马DEPs富集分析显示，SCP组海马主要参与可卡因成瘾、安非他命成瘾、多巴胺能突触等14 条通路（图5A）。在这14 条通路中，认知和记忆系统有3 条上调通路，包括多巴胺能突触、5-羟色胺（5-hydroxy tryptamine，5-HT）能突触和突触囊泡循环。这3 条通路与多巴胺（dopamine，DA）和5-HT的产生、囊泡运输和突触可塑性的促进有关，涉及某些DEPs。为验证上述途径中的DEPs和代谢途径的下游介质（5-HT和DA）的水平，进行了Western blot和酶联免疫吸附试验，如图5C～G所示。如图5C～E所示，SCP组酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）、多巴脱羧酶（dopamine，DDC）及下游介质（5-HT和DA）的表达量呈剂量依赖性高于模型组。然而，SCP给药导致小鼠海马中下游代谢物（DA和5-HT）和关键蛋白（TH和VMAT2）水平的增强，特别是在高剂量下（图5F～G）。关键蛋白和下游介质水平的结果不仅与蛋白质组学的数据相吻合，而且解释了SCP对记忆受损小鼠的改善作用。结果表明，TH和VMAT2的表达水平在多巴胺能突触通路中显著上调。H-SCP组的AC5水平比模型组显著增加了2.44 倍。SCP组AC5表达上调可能与突触可塑性和记忆增强有关。值得注意的是，DDC不仅催化DA的分泌，而且在5-HT的合成中起着至关重要的作用。在本实验中，SCP组囊泡单胺转运蛋白（vesicular monoamine transporter，VMAT）的表达显著上调。与模型组相比，SCP组VMAT2蛋白表达水平增加了3 倍。SCP辅助小鼠海马记忆增强的分子机制见通路图5B。综上所述，SCP可介导DA和5-HT的分泌和转运，从而预防东莨菪碱引起的记忆损伤。值得一提的是，5-HT和DA的代谢紊乱与抑郁症密切相关。A. DEPs的KEGG通路富集；B. SCP通过调节DA和5-HT代谢预防记忆障碍的分子机制通路示意图，其中绿色蛋白参与多巴胺代谢的调节，黄色蛋白参与5 -HT代谢的调节，蛋白质组学中显著上调的蛋白用红色背景标记；Western blotting分析蛋白相对表达量，内参蛋白β-actin。免疫印迹图，C. TH和VMAT2；相对表达水平，D. TH，E. VAMT2；F. DA含量；G. 5-HT含量。
图5 H-SCP模型中DEPs的KEGG通路富集及记忆相关通路分析从SCP中共检测出1 467 个多肽。92%以上的SCP是20 个氨基酸以内的短肽。部分肽表现出甲基化、二羟基化、乙基化、脱酰胺化等修饰特征。研究发现，一些鉴定出的SCP含有已报道的神经保护氨基酸序列（如PAY、GR、IGL和GPE）。这些SCP类型（如LQFPVGR、GIGTVPVGR、SLPGIGL、DGPEGPRGPPGSEGRQ、ILTPAYKDTPL）可能在胃肠道消化过程中释放神经保护氨基酸序列，因此可以作为潜在的神经保护肽进行进一步研究。令人遗憾的是，报道的神经保护肽没有在SCP中获得。因此，计算SCP的PeptideRanker评分，以发现新的潜在的神经保护肽。表1列出了PeptideRanker评分前5 位的肽段，包括氨基酸序列、肽段长度、PeptideRanker评分和MS-MS谱。这些潜在的神经保护肽（含有神经保护氨基酸序列且具有较高的PeptideRanker评分）可以通过分子对接和体内实验进一步验证。SCP的鉴定为今后海参神经保护肽的功能验证和开发奠定基础。表1 使用PeptideRanker评分从SCP中鉴定出前5 个肽
本研究阐明了SCP预防东莨菪碱诱导小鼠认知功能障碍的潜在神经保护机制，并鉴定了SCP的肽序列。关于SCP在防止记忆障碍中的作用，水迷宫测试的结果提供了与空间记忆有关的直观证据。随后，对海马的蛋白质组学分析表明，SCP通过参与调节乙酰胆碱代谢、神经元形态、突触可塑性以及DA和5-HT代谢的激活来调节记忆障碍。此外，对蛋白质组学数据的关键蛋白和下游产物进行了验证。这些发现表明，SCP有可能通过调节神经递质信号和突触可塑性来减轻记忆障碍。因此，SCP可能成为食品和制药部门神经保护的有希望的备选物质。值得说明的是，DA和5-HT水平的降低与抑郁症密切相关。SCP的辅助抗抑郁可能是未来的发展方向。同时，在蛋白质组学中发现的一些与神经功能相关的DEPs需要进一步研究。此外，从SCP中筛选神经保护肽（一种特殊氨基酸序列）有待进一步研究。文章《Sea cucumber peptides protect against memory impairment by regulating dopamine/serotonin metabolization and synapse plasticity of mice hippocampus》发表于Journal of Functional Foods 2023年108卷
大连工业大学林松毅教授为本文通信作者
文章链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S03328
林松毅，工学博士，教授，博士生导师，辽宁省特聘教授，现任大连工业大学食品学院食品功能与营养学术带头人，担任辽宁省食品工程技术研究中心副主任；兼任全国工程教育认证专家（食品科学与工程类专业认证）、国家科学技术奖励评审专家、“长江学者奖励计划”/“青千计划”等评审专家、国家自然科学基金项目评审专家、中国博士后科学基金会立项评审专家、中国轻工业联合会科学技术奖励评审专家、河北省/河南省/山东省/福建省/内蒙古科技奖励评审专家、教育部研究生学位论文通讯评议专家；担任中国食品科学技术学会高级会员、中国食品科学技术学会非热加工技术分会理事；Recent Advancement in Food Science and Nutrition Research编委、《肉类研究》编委；担任Journal of Agriculture and Food Chemistry、Food Chemistry、Food & Function等40余个国际期刊杂志的审稿专家等。先后主持或承担国家级、省市级、校企合作课题累计近50 项；发表学术研究论文200余篇，其中以第一作者或通信作发表者SCI检索论文近100 篇和EI检索论文31 篇；以第一发明人申请发明专利52 件，其中获授权发明专利近30 件；以第一完成人获省级自然科学成果奖一等奖1 项、二等奖1 项；以并列主编出版国家“十二五”规划教材《功能食品学》；培养研究生52 人。新刊启动 Food Science of Animal Products《动物源食品科学》（英文），欢迎投稿
Food Science of Animal Products（ISSN: 2958-4124, e-ISSN : 2958-3780）是一本国际同行评议、开放获取的期刊，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心主办，中国食品杂志社《食品科学》编辑团队运营，属于食品科学与技术学科，旨在报道动物源食品领域最新研究成果，涉及肉、水产、乳、蛋、动物内脏、食用昆虫等原料，研究内容包括食物原料品质、加工特性，营养成分、活性物质与人类健康的关系，产品风味及感官特性，加工或烹饪中有害物质的控制，产品保鲜、贮藏与包装，微生物及发酵，非法药物残留及食品安全检测，真实性鉴别，细胞培育肉，法规标准等。
投稿网址：
https://www.sciopen.com/journal/2958-4124
